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DNA凝胶接管

  10/09 Ver.1 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至 8 μg DNA(70bp-10Kb) ,回收率为 60-85%。琼脂糖凝 胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中熔化,其中的保护剂能防止线状 DNA 在高温下降解,然后在 DE-B 溶液 的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的 DNA 纯度高,并保持片断完整性和高生物活性,可直接用于 连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 Cat. No. 制备次数 制备管 2 ml 离心管 1.5 ml 离心管 Buffer DE-A Buffer DE-B Buffer W1 Buffer W2 concentrate Eluent 说明书 AP-GX-4 4 preps 4 4 4 6 ml 3 ml 2.8 ml 2.4 ml 1 ml 1 AP-GX-50 50 preps 50 50 50 2×33 ml 33 ml 28 ml 24 ml 5 ml 1 AP-GX-250 250 preps 250 250 250 2×165 ml 165 ml 135 ml 2×72 ml 25 ml 1 Buffer DE-A:凝胶熔化剂,含 DNA 保护剂,防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B:结合液(促使大于 70bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上) 。室温密闭贮存。 Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate: 去盐液, 使用前, 按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇 (用 100%乙醇或 95% 乙醇) ,混合均匀,室温密闭贮存。 Eluent:洗脱液,室温密闭贮存。 二、注意事项 1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇)、Buffer DE-B 和 Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套 和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水 或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。 2. 在步骤 1 中,将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间(线型 DNA 长时间暴露在高温条件 下易于水解) 从而提高回收率。 , 勿将含 DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下, 减少紫外线对 DNA 造成的损伤。 爱思进生物技术(杭州)有限公司 电话 传真Page 1 在步骤 2 中凝胶必须完全熔化,否则将严重影响 DNA 回收率。 4. 将 Eluent 或去离子水加热至 65°C,有利于提高洗脱效率。 5. DNA 分子呈酸性,建议在 2.5 mM Tris-HCl,pH 7.0-8.5 洗脱液中保存。 三、实验准备 1. 第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 4. 使用前,检查Buffer DE-B是否出现沉淀,若出现沉淀,应于70°C温浴加热熔化并冷却至室温后再 使用。 四、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提 前记录 1.5 ml 离心管重量) ,该重量作为一个凝胶体积(如 100 mg=100 μl 体积) 。 2. 加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE-A,混合均匀后于 75°C 加热(低熔点琼脂糖凝胶于 40°C 加热) ,间 断混合(每 2-3 min) ,直至凝胶块完全熔化(约 6-8 min) 。 * Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中,可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3. 加 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B,混合均匀。当分离的 DNA 片段小于 400bp 时,需再加 入 1 个凝胶体积的异丙醇。 * 加 Buffer DE-B 后混合物颜色变为黄色,充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 步骤 4-6 可以选择负压法或离心法。 A. 负压法 4A. 正确连接负压装置,将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液,转移到 制备管中,开启并调节负压至-25-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。 5A. 加 500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。 6A. 加 700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用 700 μl Buffer W2 洗涤一次。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除,消除对后续实验的影响。 7A. 将制备管置于 2 ml 离心管(试剂盒提供)中,12,000×g 离心 1 min。 爱思进生物技术(杭州)有限公司 电话 传真 E-mail: .cn Page 2 离心法 4B. 吸取步骤 3 中的混合液,转移到 DNA 制备管(置于 2 ml(试剂盒内提供)离心管)中,12,000×g 离心 1 min。弃滤液。 5B. 将制备管置回 2 ml 离心管,加 500 μl Buffer W1,12,000×g 离心 30 s,弃滤液。 6B. 将制备管置回 2 ml 离心管,加 700 μl Buffer W2,12,000×g 离心 30 s,弃滤液。以同样的方法 再用 700 μl Buffer W2 洗涤一次 12,000×g 离心 1 min。 * 确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用 Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除,消除对后续实验的影响。 7B. 将制备管置回 2 ml 离心管中,12,000×g 离心 1 min。 8. 将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中,在制备膜中央加 25-30 μl Eluent 或去离子 水,室温静置 1 min。12,000×g 离心 1 min 洗脱 DNA。 * 将 Eluent 或去离子水加热至 65℃将提高洗脱效率。 五、流程图 含有目的 DNA 凝胶 计算凝胶体积 加 3 倍凝胶体积 Buffer DE-A, 温浴 75°C 熔 化凝胶 加含 0.5 个 Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B 加 500 μl Buffer W1 加 700 μl Buffer W2 加 700 μl Buffer W2 加 25-30 μl Eluent 或去离子水 熔化 结合 洗涤 洗脱 爱思进生物技术(杭州)有限公司 电话 传真 E-mail: .cn Page 3 六、常见问题分析 主要问题 回收率低 原因 1. 目的片段结 合量低 1) 琼脂糖凝胶未完全熔化时目 的片段只有部分结合到膜 上,导致其余的片段在后续 洗涤过程中丢失以及出现制 备管堵塞现象,最终影响回 收效率。 2) 小于 400bp 的片段未加异 丙醇 3) 电泳缓冲液 pH 值过高,影 响目的片段的结合 2. 结合的 DNA 片段过早的被 洗脱 3. 洗脱效率低 Buffer W2 中未加无水乙醇 或者乙醇浓度不是 95 100%的 最后一次 Buffer W2 洗涤完后不要将制备管放于负压 装置上抽得过干。 洗脱液或者去离子水 65°C 预热以及增加洗脱前静置 时间至 5min,都可提高洗脱效率。 选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳, 上样量不超过制备 管的最大结合量(8μg) 。 后续酶促反 应不理想 2. 乙醇污染 在最后一次 Buffer W2 洗涤后可将制备管离心时间由 原来 1min 增加至 2min。 3. 琼脂糖残留 切胶时尽可能去除不含有 DNA 片段部分的凝胶以便 于对琼脂糖的处理,确保琼脂糖块在 Buffer DE-A 中 完全熔化。 4. 洗脱产物中含有 ssDNA 将洗脱产物 95℃加热 2min,慢慢冷却至室温,使单 链 DNA 重新退火即可。 1. 盐污染 确保用 Buffer W2 洗涤 2 次。 确保加入正确的乙醇量。每次使用后应拧紧瓶盖,以 免乙醇挥发,降低回收率。 建议加入 10μl 3M NaAC 中和。 务必确保已加入 1 倍凝胶体积的异丙醇(100%) 。 建议 在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖,确保 buffer DE-A 的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查 确保无固体琼脂糖残留, 间隔性的对样品进行摇晃促 进凝胶的充分熔化。 爱思进生物技术(杭州)有限公司 电话 传真 E-mail: .cn Page 4

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